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      文章正文
      實驗結果至關重要:分子篩的使用并不復雜
      作者:    發布于:2018-07-12 09:29:26    文字:【】【】【

      分子篩(SEC)無疑是許多色譜方法中最精細的存在。高分辨率,高性能的色譜柱對于獲得令人滿意的實驗結果至關重要。剛剛接觸過層析成像的小朋友們已經接管了這個精致的支柱。你不覺得有一種心跳加速,沒有開始的感覺嗎?如何保持如此精致的支柱?別擔心,讓我們了解一下?

      首次使用建議:

      在連接色譜柱之前,請務必確認流路中沒有空氣!通常,柱子儲存在20%乙醇溶液中以避免微生物的增殖,但20%乙醇的粘度高于水溶液的粘度,因此需要降低。流速可防止床被壓縮。

        結論是:

      將色譜柱連接到系統,確保連接時色譜柱前部的流路中沒有氣泡;

      使用緩沖液置換色譜柱中的酒精時,使用低流速;

      如有必要,測試色譜柱的耐壓參數(增加系列);

      您的專欄已準備就緒

      剛才我們也提到了效率測量。這個參數是什么?我們應該做什么?

      色譜柱效率是測量色譜柱和儀器性能的快速方法。也許你會問,我們一直在談論專欄,為什么我們提到這個樂器?實際上,儀器管道的厚度為、死體積會對柱效應的結果產生影響,因此,要評估一列的性能,需要相同的儀器是在相同的實驗條件下進行的。通常,我們可以使用1%體積的1%丙酮來吸收280nm處的檢測。具體操作在每列的手冊中詳細描述。此外,?KTA儀器還可以通過峰值積分快速計算結果。

      在實驗過程中需要注意哪些方面?

      1.低溫操作:為了保護蛋白質的穩定性,許多小伙伴選擇在低溫下進行色譜分析。然后必須提醒您,當溶液冷時粘度會增加,所以一定要降低流速。此外,重要的是要注意所有溶液都保持與色譜柱相同的溫度,以避免因溫度變化而引入氣泡。

      2.樣品制備:良好的樣品是實驗成功的第一步。對于分子篩,所有樣品必須通過0.22μm過濾器(或10,000 g,10分鐘以除去上清液)過濾,以防止顆粒堵塞色譜柱。此外,在實驗過程中,必須確保樣品在pH值為、的條件下不會變性或聚集和沉淀。如果您需要使用增溶劑(如洗滌劑),請確保在實驗過程中同時添加樣品、溶液。3.緩沖溶液:分子篩屬于非吸附色譜。只需要一個緩沖溶液。它具有很好的兼容性?;旧?,我們只需要考慮蛋白質的穩定性來選擇合適的緩沖液。通常,我們將在實驗中添加150-300mM NaCl以減少非特異性吸附。當使用不同的溶液時,由于溶液本身的粘度不同,請降低流速以保護色譜柱。

      4.常規清潔:定期清潔可延長色譜柱的使用壽命并保持良好的分離度。清潔頻率與實際條件有關,例如樣品和分辨率要求。通常,如果色譜柱頂部有顏色變化,或者色譜柱的背壓增加,分辨率降低等,則會提示我們及時清潔色譜柱。對于Superdex和Superose系列色譜柱,通常建議進行反向清洗,Hiprep Sephacryl系列色譜柱通常是向前清洗的。最常見的清洗方法是使用1柱體積的0.5M NaOH(Superdex和Superose系列)或0.2M NaOH(Sephacryl系列),并立即用2柱體積的水和2柱體積的緩沖液平衡,切不要存放NaOH溶液中的色譜柱很長一段時間。

      如果常規清洗仍未達到預期效果,可根據殘留物選擇其他清洗方法:例如:0.5M乙酸溶液,1M NaOH,8M尿素或6M鹽酸胍(用于蛋白質沉淀),30%異丙基酒精(對于脂質或疏水性物質,也可以考慮用胃蛋白酶消化(1毫克/毫升,在0.1M乙酸中加入0.117乙酸溶液),然后用NaOH洗滌。

      5.儲存:如果色譜柱使用時間超過2天,建議用2倍柱體積的水清洗色譜柱,然后用2倍柱體積的20%乙醇沖洗色譜柱。 (Hiload Superdex 30pg和Hiload Superdex 75pg建議在20%乙醇中加入0.2M NaAc以維持pH穩定性)。再次,20%乙醇的粘度比較高,請注意降低流速。如果長時間存放或需要運輸,請連接保護裝置,以避免因環境變化而引入氣泡。

      事實上,沸石分子篩的使用并不復雜。只要你大膽耐心,你就能獲得良好的實驗結果?


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